过筛的土壤与植物碎片混合后用受试物处理或不加处理(对照组)。若受试物是农用化学品,则至少选用2个测试浓度,浓度设置可以参考受试物预计在田间施用的高浓度。在培养0d、7d、14d和28d后,从处理组和对照组中取出一定量的土壤样品,用合适的溶剂浸提并测定提取液中硝酸盐的含量。比较处理组与对照组的硝酸盐形成率计算处理组相对于对照组的百分比差异。所有试验至少持续28d,如果第28天处理组和对照组的差异不小于25%则试验可延至长100d。若受试物是非农用化学品,则将一系列不同浓度的受试物加到土壤样品中,并在第28天测定处理组和对照组中硝酸盐的产生量。利用回归模型对系列浓度的试验结果进行分析,并计算ECx值(即EC50、EC25和/或EC10)。
4.仪器设备
4.1 试验容器需用化学情性材料制成,且应具有与土壤培养方式相匹配的适宜的容积,即土壤样品以大批量整体的形式或者以系列分装独立的形式培养(见6.1.2)。试验过程中应尽量降低水分的损失并保持气体的交换(例如:试验容器可以覆盖带有小孔的聚乙烯箔)。如受试物具有挥发性,应采用密闭或气密的试验容器。试验容器的大小以装填的土壤样品约占其1/4体积为宜。
4.2 需要下列标准的实验室仪器:
搅拌装置(机械振动器或类似设备〕;
离心(3000g)或过滤装置(使用无硝酸盐滤纸);
具有足够灵敏度和重现性的硝酸盐分析仪器。
5.试验系统
5.1 土壤
5.1.1 土壤的选择
使用单一土壤,使用的土壤特征如下:
——砂含量:50%～75%;
——pH:5.5～7.5;
—有机碳含量:0.5%～1.5%;
——应测定微生物的生物量,其碳含量应不小于土壤总有机碳含量的1%。
在多数情况下,具有上述特征的土壤代表着差的状况,因其对受试物的吸附量小,而适合于微生物的生长。因此,通常不需要用其他土壤来进行试验。但是,在某些情况下,例如预计受试物主要用于某些特殊的土壤(如酸性森林土壤),或受试物带有静电,则需使用另外一种土壤。
5.1.2 土壤样品的采集与贮存
5.1.2.1 采集
应收集用于试验的土壤采集点的详细背景信息,包括:确切地点植被覆盖、施用过农作物保护产品的日期、有机和无机肥料的施用情况、加入的生物材料或偶然混入的污染物。选用的土壤采集点应能长期使用,如永久的草场牧地种植一年生谷类作物(玉米除外的耕地,或者密植的绿肥田地。取样地点在取样前至少一年内未施用过农作物保护产品,至少在6个月内未施用过有机肥。除非为满足农作物需要而施用无机肥料,但应在土壤施肥至少3个月后方能釆样。应避免使用那些施用过具杀生作用肥料(如氰胺化钙)的土壤。
应避免在长期干旱或水涝期间(超过30d)采样,或在此期之后立即采样。在耕地取样的深度为0cm～20cm,在长期没有耕作(至少一个生长季节)的草场牧地或其他类型的土壤中取样时,大深度可略超过20cm(例如25cm)。
运输土壤样品时应使用容器,并保持适宜的温度以确保土壤的性质不发生显著改变。
5.1.2.2 贮存
试验好使用从田间新采集的土壤。如无法避免在实验室贮存,可置于4℃±2℃黑暗处,长可保存3个月。土壤在贮存期间应保持有氧条件。如果采样地区每年至少有3个月冰冻期,也可在-18℃～-22℃条件下贮存6个月。每次试验前应测定土壤微生物的生物量,其生物量的碳含量应至少占土壤总有机碳含量的1%。。
