一.简介
圆二色光谱(简称CD)是应用最为广泛的测定蛋白质二级结构的方法，是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。它可以在溶液状态下测定，较接近其生理状态。而且测定方法快速简便，对构象变化灵敏，所以它是目前研究蛋白质二级结构的主要手段之一，并已广泛应用于蛋白质的构象研究中。
用于推断非对称分子的构型和构象的一种旋光光谱。光学活性物质对组成平面偏振光的左旋和右旋圆偏振光的吸收系数(ε)是不相等的，εL≠εR，即具有圆二色性。如果以不同波长的平面偏振光的波长λ为横坐标，以吸收系数之差Δε=εL-εR为纵坐标作图，得到的图谱即是圆二色光谱，简称CD。如果某手性化合物在紫外可见区域有吸收，就可以得到具有特征的圆二色光谱。由于εL≠εR，透射光不再是平面偏振光，而是椭圆偏振光，摩尔椭圆度[θ]与Δε的关系为：[θ]=3300Δε。圆二色谱也可以摩尔椭圆度为纵坐标，以波长为横坐标作图。由于△ε有正值和负值之分，所以圆二色谱也有呈峰的正性圆二色谱和呈谷的负性圆二色谱。在紫外可见光区域测定圆二色谱与旋光谱，其目的是推断有机化合物的构型和构象。
二．原理
光是横电磁波，是一种在各个方向上振动的射线。其电场矢量E 与磁场矢量H 相互垂直，且与光波传播方向垂直。由于产生感光作用的主要是电场矢量，一般就将电场矢量作为光波的振动矢量。光波电场矢量与传播方向所组成的平面称为光波的振动面。若此振动面不随时间变化，这束光就称为平面偏振光，其振动面即称为偏振面。平面偏振光可分解为振幅、频率相同，旋转方向相反的两圆偏振光。其中电矢量以顺时针方向旋转的称为右旋圆偏振光，其中以逆时针方向旋转的称为左旋圆偏振光。两束振幅、频率相同，旋转方向相反的偏振光也可以合成为一束平面偏振光。如果两束偏振光的振幅(强度) 不相同,则合成的将是一束椭圆偏振光。
光学活性物质对左、右旋圆偏振光的吸收率不同,其光吸收的差值ΔA ( Al - Ad) 称为该物质的圆二色性(circular dichroism ,简写作CD) 。圆二色性的存在使通过该物质传播的平面偏振光变为椭圆偏振光,且只在发生吸收的波长处才能观察到。所形成的椭圆的椭圆率θ为:θ= tg- 1 短轴/长轴
根据Lambert-Beer 定律可证明椭圆率近似地为：θ= 0. 576 lc (εl - εd) = 0. 576 lcΔε 公式中l 为介质厚度, c 为光活性物质的浓度,εl 及εd分别为物质对左旋及右旋圆偏振光的吸收系数。测量不同波长下的θ(或Δε) 值与波长λ之间的关系曲线,即圆二色光谱曲线。在此光谱曲线中,如果所测定的物质没有特征吸收,则其Δε值很小,即得不到特征的圆二色光谱。当εl >εd 时,得到的是一个正的圆二色光谱曲线,即被测物质为右旋,如果εl <εd ,则得到一个负的圆二色光谱曲线,即被测物质为左旋。
根据圆二色光谱法的原理和测试要求设计制成的仪器称为圆二色光谱仪。目前圆二色光谱法及其仪器已广泛应用于有机化学、生物化学、配位化学和药物化学等领域,成为研究有机化合物的立体构型的一个重要方法。
三．样品要求
1、样品必须保持一定的纯度不含光吸收的杂质，溶剂必须在测定波长没有吸收干扰;样品能完全溶解在溶剂中, 形成均一透明的溶液。
2、氮气流量的控制
3、缓冲液、溶剂要求与池子选择：缓冲液和溶剂在配制溶液前要做单独的检查，看是否在测定波长范围内有吸收干扰， 看是否形成沉淀和胶状；在蛋白质测量中，经常选择透明性极好的磷酸盐作为缓冲体系。
4、样品浓度与池子选择
样品不同，测定的圆二色光谱范围不同，对池子大小(光径)的选择和浓度的要求也不一样。蛋白质CD光谱测量一般在相对较稀的溶液中进行。
四．谱带宽度
1、选为1 nm。对于高分辨率测量，要用较窄的狭缝宽度，此时光电倍增管的电压较高，谱的信噪比差。虽然对于正常测量最加谱带宽度是1~2 nm，但是在下列情况下要牺牲分辨率而需要较宽的狭缝宽度。当样品的吸光度很高但CD信号很弱时，一方面要尽量保证测定CD峰所需要的足够浓度，另一方面要设置较宽的狭缝。不过此时要特别小心，因为样品在吸光度过高(A>2)的情况下可能存在荧光或杂散光引起的某些假象。另外，在固体CD光谱测试时也需要较大的狭缝宽度(一般要求 > 2 nm)。
2、椭圆率和摩尔椭圆率都依赖于测量条件。因此，温度、波长和样品浓度总是应该特别注明的。
3、当用压片法或石蜡油研磨法进行固体粉末样品测试时，要尽可能地研磨获得细小均匀的样品颗粒。采用石蜡油糊方法时，必须注意某些憎水有机化合物可能溶于石蜡油中，这时所得CD光谱在某种意义上应视为溶液CD光谱。采用压片法测试固体CD时，在保证手性样品的定性浓度达到CD光谱仪检测要求的同时，片越薄越透明越好(但切忌破损)。在某些情况下，压片法不适用于手性抗衡阴离子存在下的固体诱导CD光谱的测定。
